1.目的：该规程规定了AE31E倒置荧光显微镜的操作方法、注意事项等。使操作人员可以按照此规程进行规范操作、更好的使用和维护该仪器。

2.范围：本规程适用于AE31E倒置荧光显微镜的操作人员和维护人员，供相关实验人员参照执行。

3.引用标准：《倒置荧光显微镜使用说明书》

4.操作方法

4.1荧光滤色片的选取

为了获得最佳的观察效果，可选择其中心波长尽可能接近吸收、发射峰值的激发滤光片与阻挡滤光片。

注意: 此中心波长应处于整个带宽的中心，而不一定是最大透射波长，尽管对于一个均匀的通带其中心波长与峰值波长是相等的。

4.2激发滤光片的选择

激发滤光片有选择的让可激发荧光的某一波段的光通过而过滤掉其它的光。为了最大限度的扩大所需的荧光亮度(信号）与背景(噪声)的对比，有人选择宽波段的激发滤光片及阻挡滤光片但这样做可能引起激发光谐与发射光谱的重叠，导致分辨率变差，这是无法接受的。宽波段还可引发高度的自发荧光及严重的猝灭现象。为了尽量减少激发与发射光谱的重叠，有人反之选取窄波段的激发、阻挡滤光片，两光谱被分离，增加了信噪比。但像会变暗，因只有少量的激发光到达标本，自发荧光及猝灭现象都是最小量的。

4.3阻挡滤光片的选择

阻挡滤光片防止激发光到达观察者的眼睛。它对于激发光波透过率应尽可能低，而对从标本发出的荧光的透过率应尽可能高。阻挡滤光片可是长波通或带通型。

4.3.1长波通

滤光片仅允许某一波长以上的光通过，此波长以下的光将被抑止。当应用需要最大的发射光，而光谱的区分不是必须时，可采用长波通滤光片。在对荧光团观察时通常采用这种滤光片。在荧光团的情况标本中往往只有相当低的背景自发荧光，而产生单一的发射形态。

长波通滤光片荧光团或荧光探针:当荧光染料对标本中的其它原始活体物质，如蛋白质、抗体或核酸匹配时，由于选择性染色，使这类物质被标记出米。长波通滤光片也用于对多重染色标本上的所有染色点的观察如FITC.TRITC.

4.3.2带通

仅让某一特定波段的光通过的滤光片。带通滤光片用于对多重染色，如FITC和TRITC被同时使用，标本上的某一特定染色点的观察。带通滤光片按所需荧光亮度(信号)对背景亮度(噪声)比率最大来设计，以便于识别比所有像的亮度更重要的信号组份。若要正确的选择滤光片需对滤光片技术有透彻的了解。使用者通过对染色剂及照明的选择可改善荧光成像质量。正确的选择滤光片组合还要了解染色剂的激发和发射光谱的相关知识。

4.4浸油物镜的使用

浸油物镜上:刻有"Oil"字样,使用时在标木与物镜前端间充满浸油。Motic香柏油是一种无光致荧光现象，合成自J非树脂油，它的折射率为1.515。盖玻片通常必须同浸油物镜一同使用。但由于作为盖玻片上浸油层的补偿功能，它的厚度有所偏差，显得不重要。每个油浸物镜都配有一小瓶浸油。在使用前，先挤掉油瓶口的汽泡。香柏油必须节省使用。在使用时，必须确保香柏油中无汽泡。要检查是否有汽泡，可拿掉一个目镜，并将视场光栏尽可能的开大，通过目镜筒观看物镜的出瞳(出瞳将会呈现一个亮圈) 。如油中有汽泡，将造成观察困难，可使用对中望远镜，通过旋转望远镜的调焦圈，对物镜出瞳进行对焦来观察。若油中有汽泡，会使成像质量变差。为清除汽泡，可左右旋转物镜转换器，使物镜在油上左右摆动来去除，或滴入更多的香柏油，或擦掉油重新滴加。将一滴香柏油滴到盖玻片，然后再进行调焦。观察完后擦镜纸将物镜擦拭干净。残留在浸油元件或沾污到非浸液式物镜表面上的油污会影响成像质量。用酒精和乙醚的混合液沾湿镜头纸或擦镜布，轻轻擦试镜头表面，清除油污，然后再用纯酒精(普通酒精或甲醇)对镜表进行清洁。酒精乙醚的混合液和酒精均属易燃物，使时要小心。

4.5荧光显微摄影术

关于显微镜摄景技术的基本程序及关键要求，请参见相关说明。由于标本的颜色会失效，故在曝光前和操作过程中，都应尽量减少对标本的照射。先不使用荧光，用相衬对感兴趣的区域进行观察。选取一个对被检标本合适的滤光片组。(不管是采用单波、双被或三波滤光片组，要想获得摄影、摄像的图像均需加大曝光时间，双波与三波的比单波的所需时间更长.)因胶片上成像的亮度与像的放大率成反比，即放大率越大，亮度越低，故为获得足够的亮度，应尽可能选配较小的胶片幅面。即使与摄影物镜组合的总放大倍数相同，每个物镜的曝光时间也是不同的。应选择较高数值孔径的物镜来提升放大倍数。(物镜的数值孔径随着放大率的提高而增大，且数值孔径越高，图像亮度越高。)过强的激发光会使标本褪色，可通过在光路中插入一片中性滤色片的方式来调整光强，因为这种滤色片在较大波长范围内提供恒定的透过率。
调整集光镜使照明更亮，或者更均匀。在对标本不进行观察及拍照时，通过遮挡激发光来防止标本失效。

4.6 荧光显微电视摄像术

电子摄像采用了电子探测器件来获得图像，为避免红外光产生错误卖数，将一个IR截止滤光片插入光路中，将能获得较好的结果。

5、注意事项

5.1镜头及滤色片

对于镜头表面及滤色片的清沽，首先用洗耳球将浮表的灰尘吹掉，如若仍有污物存在，最好用柔软干净的刷子或纱布清除。蘸上无水乙醇与乙醚的混合液(按3:7的比例，无水乙醇3:乙醚7)的纱布或镜头纸仅可除去指纹、油脂等污迹。用无水乙醇与乙醚的混合液(按3:7的比例，同上)擦除香柏油油污。物镜上的香柏油油污仅能用无水乙醇与乙醚的混合液(按3:7的比例，同上)擦除。因无水乙醇与乙醚的混合液易燃烧，在有明火的环境中操作时要格外小心。不要用纱布或镜头纸对同一区域多次擦试。

5.2除有油漆的零件及塑料件的清洁
禁止使用有机溶液(如乙醇、乙醚、稀释液等)或其稀释液清洗。否则将导致漆层退色或脱皮。顽固污物可以用蘸有软性清洁剂的纱布擦拭。塑料表面只能用软布蘸上清水来清洁。
5.3 不使用时的维护

当不使用时，用乙烯防尘罩罩住仪器，放在湿度较低，不易使仪器发霉的地方。物镜、目镜及滤色片要放入带有干燥剂的容器中。正确操作可保证显微镜长期无故障使用。

5.4荧光滤光片组(25mm系列)

荧光装置可装3个滤光片组和一个占位块以进行明场观察。滤光片组安装在荧光装置中的滤光片组滑板上，通过滤光片组切换拨杆把滤光片组转到光路中。每个滤光片组都有一个相应的标签，被插在滤光装置前的标签插槽里，操作者可方便选择合适的滤光片组来进行荧光观察。由于热辐射和强光的照射，随着时间的推移，激发滤光片会逐渐老化。更换是必要的。对多波段滤光片要额外小心，因它表面复杂的镀膜层较易损伤。特别注意要防潮。当不使用时，请放在干燥缸中保存。